1. 熔解曲线出现非特异峰

           目的峰前面，Tm=75左右出现的峰为引物二聚体峰；紧挨着目的峰前后，有可能是非特异产物峰或者gDNA扩增峰；分析如下：

1) 引物设计不优，需根据设计原则设计合成新的引物。

2) 引物浓度太高：适当降低引物浓度。

3) 检测的目的基因同源家族基因较多，重新设计引物或采用探针法进行定量检测；

4) cDNA模板带有基因组污染：重新制备cDNA模板。

2. 扩增曲线形状异常

1) 扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。

2) 扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于CT值。减小基线终点(C T值 - 4)，重新分析数据。

3) 个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心，进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

3. 反应结束无扩增曲线出现

1) 反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。

2) 确认程序中是否设置了信号采集步骤：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72°C
延伸阶段。

3) 确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。

4) 模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

5) 模板降解：重新制备模板，重复实验。

4. CT值出现太晚

1) 扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计合成引物。

2) 模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

3) 模板降解：重新制备模板，重复实验。

4) PCR产物太长：推荐PCR产物长度为80-150 bp。

5) 体系中存在PCR抑制剂：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。

5. 阴性对照出现明显扩增

1) 反应体系污染：更换新的Mix、ddH 2 O、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。

2) 引物二聚体的出现：配合熔解曲线进行分析。

6. 绝对定量时标准曲线线性关系不佳

1) 加样误差：提高模板稀释倍数，提高加样体积。

2) 标准品降解：重新制备标准品，重复实验。

3) 模板浓度太高：提高模板稀释倍数。

7. 实验重复性差

1) 加样体积失准：使用性能较好的移液枪；将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。

2) 定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。

3) 模板浓度太低：模板浓度越低，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。

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