产品概述

 本产品为经优化的TOPO克隆试剂盒，产品使用了新型的Topoisomerase，添加二代平末端化因子和载体自连抑制，配合最适buffer，得本产品能够在5 min内快速完成TA克隆及平末端克隆。

产品特点&优势

—阳性率高，可达95%以上；

产品组成

*1.包含Topoisomerase和TOPO Vector(Amp抗性载体)。
*2. 包含M13 Forward Primer和M13 Reverse Primer。

操作流程

1. 反应体系配制

*1.插入片段最适使用量=[0.02×片段长度] ng，若接入片段较大时可适当增加用量，但不建议超过最适量的2倍。

1.克隆转化

1)  用移液枪轻柔吹打混匀后离心至底部。

2) 20~37 ℃反应5 min(推荐使用25 ℃，5 min，PCR仪控温)。

3)  反应结束后，将离心管置于冰上。

4) 将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，如下:

【以化学感受态细胞DH5α转化方法为例。】

1. 感受态细胞于-80℃冰箱取出后于冰上融化（注：感受态细胞融化后不可久置，不可反复冻融）；

2. 取5 µl连接反应液加入至100 µl感受态细胞中，混匀，冰浴30 min；

(注：100 µl感受态细胞不要添加多于10 µl的反应液，反应液添加过多可能会降低转化效率)；

3. 42℃水浴45 sec；

4. 水浴后迅速置于冰上2 min；

5. 加入900 µl LB或SOC培养基，37℃ 200 rpm培养1 h；

6. 取100 µl菌培养液均匀涂布于带有抗性的LB固体培养基上，37℃恒温箱倒置培养~16 h；

7. 阳性克隆筛选。(推荐使用本公司产品PCR101进行菌落PCR鉴定，引物为本试剂盒提供的M13 Primer Mix (10 μM))

保存条件

-30~-15 ℃保存，干冰/-20 ℃运输。

注意事项

ü 本制品每次使用时务必使用桌面离心机点离后用移液枪轻柔地吹打混匀，避免剧烈震荡，以免酶失活。

ü 反应体系需要在冰上配制，配制好的反应液需轻柔混匀离心后再放置于PCR 仪中反应。

ü 引物5'端不能磷酸化。